石斛屬物種植物形態非常相似,分類特征主要集中在花器官性狀上,且物種之間還存在一定相同的形態特征,其物種鑒定一直被認為是植物分類領域中的難題。對于藥材石斛來說,已經完成喪失了花的特征,比原植物更難鑒定。
DNA分子標記是指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段,其不受器官、發育階段、外界環境的影響,已廣泛用于中藥材、中藥飲片的分子鑒定。在開展分子鑒定之前,首先要利用分子系統學手段對鑒定對象和鑒定標記進行評估。
為了獲得準確、客觀的結果,取樣的數量和范圍至關重要,尤其是針對石斛這種復雜的品種。“會當凌絕頂 一覽眾山小”,在全屬采樣的基礎上,分析物種與物種之間的關系,才能避免因“盲人摸象”而做出不正確的判斷。
中國中醫科學院中藥資源中心石斛研究團隊花費10年時間,對亞洲大陸石斛屬184種1600個樣品開展研究,在準確進行標本鑒定的和嚴格篩選的基礎上,利用不同基因片段對這些標本進行分子系統學分析。
基于基因進化樹和TaxonDNA軟件分析進行物種鑒定率評估,其中ITS+matK在所研究的DNA條形碼及其組合中物種鑒定率最高,184個物種的鑒定率為72.16%。基于上述方法,隨機挑選石斛屬5種植物進行物種鑒定,鑒定率為100%;但隨機挑選石斛屬91種植物進行物種鑒定,其鑒定率降為79.12%。隨著物種數量的增多,基于ITS+matK進行物種鑒定的準確性越低,因此建立覆蓋中國石斛屬植物DNA片段數據庫對于藥材的鑒定具有重要的意義。
對于具體品種,是否能選用某種DNA標記進行鑒定,需要具體分析,才能做出判斷。如銅皮石斛D.moniliforme,通過基因進化樹分析,利用ITS+matK無法將其與霍山石斛、梵凈山石斛、河南石斛等鑒別;而金釵石斛則可以和其他石斛物種鑒別。
上述基礎工作以及石斛屬藥材原植物DNA片段數據庫的建設,為進一步建立石斛藥材分子鑒定方法奠定了堅實的基礎。
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